CAR-NK和CAR-M为肿瘤免疫治疗再添助力

2021-07-21 13:22:52 134

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嵌合抗原受体（CAR）是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤取得了巨大的成就。然而CAR-T细胞仍存在一些不足，例如在实体瘤的治疗中显示出很低的疗效等。

以CAR技术为核心的新型细胞疗法，CAR-NK、CAR-NKT、CAR-巨噬细胞（CAR-M）、CAR-Treg、CAR-γδT等异军突起，在肿瘤的免疫治疗中展现出广阔的前景。本文简述其中两类：CAR-NK、CAR-M。



CAR-NK细胞






1.1 CAR-NK的研究概况  



CAR-NK临床前研究的数量逐年增加，这体现在每年都在增加的关于CAR-NK的研究论文。


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此外，在研究的靶标方面，Her2是实体瘤最常用的靶点，而CD19抗原在血液肿瘤中最常见。使用原代NK细胞的研究中，65%的人在研究B细胞恶性肿瘤，CD19是最受欢迎的靶点。有趣的是，在使用NK细胞系的研究中，研究实体瘤是血液恶性肿瘤的2倍以上。


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在临床研究方面， CD19-CAR-NK细胞对血液系统肿瘤有很高的应答率。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK细胞临床研究也针对CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有几种针对血液恶性肿瘤的CAR-NK细胞临床试验正在进行中。

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还有多项针对实体瘤的研究处于启动或招募阶段。

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1.2 CAR结构的设计  

NK细胞上表达的功能性CAR分子由三部分组成：胞外结构域、跨膜区以及胞内的信号结构域。胞外结构域由一个信号肽和识别抗原的单链抗体片段（scFv）组成，一段铰链区将这个结构连接到跨膜区，它也在细胞内连接到包含激活信号的胞内结构域。成功的CAR设计是通过仔细的设计和功能测试相结合来实现的。

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载体骨架和启动子



载体骨架包含表达CAR所需的所有元件，如启动子、polyA信号和转录调控片段。
启动子的选择直接影响到转基因的表达水平。目前，对不同启动子在NK细胞系中的CAR表达和功能的比较只有一次报道，而对原代NK细胞没有比较数据。就这一次单个报告来看，还不能确定CAR-NK细胞的最佳启动子。

目前关于CAR-NK细胞的报道显示，多种启动子被用于驱动CAR的表达，无论是细胞系来源的还是原代NK细胞。在原代CAR-NK和CAR-NK细胞系中，病毒启动子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比组成性活性启动子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信号肽


在信号肽中存在着巨大的异质性，这直接转化为不同水平的蛋白质分泌效率。对于CAR-NK和CAR-T细胞，还没有确定最佳信号肽的比较研究。目前，CD8a-SP是原代NK细胞最常用的信号肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK细胞系的免疫球蛋白重链或轻链信号肽（29%）。

单链抗体


单链抗体片段是CAR的肿瘤抗原结合域，该结构域将决定CAR-NK细胞的特异性和功能。

由于单链抗体不是抗体的天然形式，因此重链和轻链的顺序是人工确定的。到目前为止，对于CAR-NK设计，大多数更喜欢VH-VL方向，而不是VL-VH方向。Fujiwara等人证明重链和轻链的顺序不影响T细胞上抗KDR CAR的表达水平。

此外，细胞可以配备多个单链抗体，从而扩大CAR效应细胞的抗原识别能力。在这里，有多种选择：CARs可以用双元件的载体转导，诱导两个CAR结构的表达；或者将两个单链抗体融合在一个结构中，产生串联单链抗体的“单柄”CAR。虽然这些技术已用于生产CAR-T细胞，但CAR-NK细胞仍未知。

目前大多数临床CAR-T细胞试验都使用了来自小鼠抗体的单链抗体，这增加了抗小鼠IgG细胞宿主抗移植物病的风险，这个问题可以通过人源化或筛选全人抗体避免。然而不幸的是，由于这些CAR受体的嵌合特性，即使是人源化的单链抗体也可能诱导宿主抗独特型免疫反应。幸运的是，在迄今为止数量有限的CAR-NK临床试验中，没有发现与抗CAR免疫反应相关的重大副作用。

连接区


重链和轻链之间的连接区有助于稳定单链抗体的构象，过短会导致多聚体的形成，过长可能导致水解或降低VH和VL结构域之间的关联。对于CAR-NK细胞，五肽GGGGS的多聚体应用最为广泛，通常为3个重复。另一个旨在增强蛋白水解稳定性的连接体是Whitlow“218”连接体：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。
目前，虽然大多数CAR-NK研究没有提供连接细节，但已有的研究报道中，有22项使用了G4S连接，有2项应用了218连接。

铰链区


铰链区是连接单链抗体单位和跨膜结构域的CAR细胞外结构区，它通常维持效应细胞中稳健的CAR表达和活性所需的稳定性。大多数CAR-NK构建使用CD8α或CD28胞外结构域的衍生物或基于IgG的铰链区。

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铰链区的类型和长度对CAR的功能活动有重要影响。但是目前大多数信息全来自CAR-T领域，能否直接转化为CAR-NK还有待证明。

在CD28和CD8α铰链区之间的直接比较中，发现CD28更有可能促进CAR分子的二聚化，因此，CD28铰链区的CAR产生的激活刺激更强。虽然这可能是有益的，但也可能导致更严重的副作用。

IgG为基础的铰链区也广泛应用于CAR结构。基于IgG铰链区的一个主要优点是结构的灵活性，该结构通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3结构域组成。铰链区的长度可以调节以适应抗原识别，但研究发现，间隔区越短，细胞因子的产生越高，CAR-T细胞增殖越快，体内持久性和抗肿瘤效果越好。

对于CAR-NK细胞，大多数研究在原代NK细胞（16/35）和CAR-NK细胞系（41/72）中均采用CD8α铰链区。其它使用的铰链区包括CD28、IgG Fc结构域和DAP12。

跨膜结构域


跨膜（TM）结构域连接CAR的胞外结构域和细胞内激活信号结构域，CAR-NK最常用的TM部分来自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。

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TM结构域的选择影响了CAR结构在细胞功能上的活化程度。通常在NK细胞上表达的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM会导致更多的CD107a脱颗粒和更高的细胞毒性，因此，TM的具体来源将决定CAR-NK的活性。

TM结构域的一个重要方面是，最佳TM区域应遵循T细胞或NK细胞上跨膜蛋白的蛋白质自然取向（N端到C端顺序）。NKG2D虽然是一种强大的NK细胞激活剂，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜区。

目前，CD8α和CD28修饰的TM在原代CAR-NK细胞中最常见，而CD28是CAR-NK细胞系的首选TM区域。

1.3 CAR-NK激活信号


CAR的细胞内激活信号的数量决定了其属于哪一“代”CAR。

第一代CAR-NK细胞与CAR-T细胞一样，只含有CD3ζ信号。第二代和第三代CAR-NK分别携带一个和两个额外的共刺激信号，共刺激分子通常来源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相关受体家族（2B4）。到目前为止，唯一公布的CAR-NK临床试验采用了第二代CAR-NK构建，该构建通过加入IL-15表达和诱导Caspase9增强活性。

目前大多数CAR结构依赖于CD3ζ链信号域，强烈的激活信号对于诱导有效的抗肿瘤反应很重要，但也可能导致效应细胞的快速衰竭。因此，共刺激域的组合可用于校准所需的免疫细胞反应。与基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表现出更快的效应器特征，诱导更高水平的IFN-γ、颗粒酶B、TNF-α。然而，这种强烈的共刺激信号也会导致活化诱导的细胞死亡（AICD）。

相比较，4-1BB-CD3ζ信号优先诱导记忆相关基因和持续的抗肿瘤活性。原因可能是4-1BB结构域改善了CD28结构域引起的T细胞耗竭。

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如上图所示，在CAR-NK细胞系和原代CAR-NK细胞的研究中，CD3ζ几乎被普遍用作主要的激活域，其中大约一半携带一个额外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代结构，CD28/4-1BB/CD3ζ的组合是最常用的。

目前，对CAR-NK细胞的研究越来越多，基于CAR-T细胞治疗的成功经验，以及新技术和新方法的应用，相信CAR-NK细胞治疗一定能够克服种种挑战，为肿瘤治疗带来新的突破。

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CAR-巨噬细胞



鉴于目前CAR-T细胞治疗的成功和CAR-NK细胞的发展潜力，研究人员对开发用于肿瘤免疫治疗的CAR巨噬细胞（CAR-M）产生了极大的兴趣。CAR-M的出现为治疗实体瘤开辟了新的可能性：用特异性CARs修饰人巨噬细胞，以提高巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性和抗原呈递。




2.1 CAR-M的研究进展  

目前使用CAR-M治疗癌症已进行了多种尝试。研究人员设计了嵌合抗原受体吞噬细胞（CAR-P），它可以引导巨噬细胞吞噬特定的靶细胞。

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研究证明，表达Megf10或FcRv胞内结构域的CAR-P可促进对靶抗原的吞噬能力。CAR-PMegf10可以特异性地触发对靶向配体的吞噬作用，通过酪氨酸磷酸化的局部信号级联反应启动吞噬，TCR-CD3ζ可能通过招募syk激酶而促进CAR-P的吞噬作用。

全细胞吞噬是比较罕见的，而啃咬靶细胞更为频繁，这表明CAR-P巨噬细胞与靶细胞之间的相互作用不足以触发直接的全细胞吞噬。已有研究发现，PI3K信号在大靶点的内吞过程中起重要作用，可以促进巨噬细胞的吞噬作用。研究人员将pI3K p85亚单位与CAR-P-FcRv连接起来，形成一个“串联”CAR（CAR-Ptandem）。CAR-Ptandem具有较好的全细胞吞噬功能。

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宾夕法尼亚大学的研究人员使用含有CD3-ζ胞内结构域的抗HER2的CAR-M。在两种实体瘤移植的异位小鼠模型中，单次注射抗HER2-CAR-M可降低肿瘤负荷，延长小鼠存活时间。在人源化小鼠模型中还发现， HER2-CAR-M能够将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，诱导炎症性肿瘤微环境，增强T细胞的抗肿瘤细胞毒性。此外，还发现HER2-CAR-M可能产生表位扩散，为避免肿瘤免疫逃逸提供了新思路。

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Zhang等人利用诱导多能干细胞（iPSCs）表达CAR结构并分化为巨噬细胞，命名为CAR-iMac。研究表明，表达CAR的iPSCs能分化为巨噬细胞样细胞，在无抗原的情况下，CAR-iMac更接近M2极化状态。然而，在存在特异性抗原的情况下如CD19，CAR介导的信号促进了CAR-iMac的吞噬作用，并导致CAR-iMac向促炎的M1型的转化。iPSC来源的巨噬细胞可能成为髓系肿瘤免疫治疗的重要细胞来源。

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CAR-T治疗实体瘤无效的一个重要原因是T细胞难以进入肿瘤组织。这是因为实体瘤细胞外基质（ECM）形成的物理屏障阻止了T细胞进入肿瘤组织。ECM由高度有序的纤维分子、糖蛋白和其他大分子产生，其合成和降解主要受基质金属蛋白酶（MMPs）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的调控，而巨噬细胞就是MMP的重要来源。

研究人员设计了一种CAR-147的结构，它由靶向人HER2的单链抗体、IghG1的铰链区和小鼠CD147分子的跨膜和细胞内区域组成。CAR-147与HER2+人乳腺癌细胞共培养后，在CAR-147巨噬细胞中诱导多个MMP的表达，证明CAR-147能特异性识别HER2抗原，有效激活巨噬细胞中MMP的表达。CAR-147巨噬细胞在体外不抑制肿瘤细胞增殖，但静脉注射CAR-147巨噬细胞可显著抑制4T1乳腺癌小鼠模型的肿瘤生长。同时发现用CAR-147巨噬细胞治疗的肿瘤中T细胞所占的比例远高于对照巨噬细胞治疗的肿瘤，说明CAR-147巨噬细胞能破坏肿瘤细胞外基质，促进T细胞向肿瘤浸润。




2.2 CAR-M治疗实体瘤的临床应用  

直到2020年11月，两个基于CAR-M策略的临床试验已经获得FDA的批准。第一个是来自CARISMA Therapeutics的候选药物CT-0508，它用抗HER2的CAR-M治疗复发/难治性HER2过度表达的肿瘤患者（I期临床试验）。另一个是Maxyte的MCY-M11，它利用mRNA转染PBMC表达靶向间皮素的CAR（包括CAR-M），治疗复发/难治性卵巢癌和腹膜间皮瘤患者，目前正在招募志愿者进行I期临床试验。

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关于CAR-M的临床转化，有几个方面需要注意：第一，CAR-M的安全性和有效性是该疗法的基础，虽然已经通过动物实验进行了验证，但CAR-M在人体内的安全性和有效性仍有待验证；其次，可靠的细胞来源和扩增是CAR-M临床应用的必要条件，CAR-M可由PBMC或iPSCs制备。此外，与T细胞不同，巨噬细胞发生GVHD的风险较低，这意味着可以提前生产产品，供患者按需使用。第三，还有一个问题必须考虑，目前，CAR-M多采用病毒转染的方法，可能会诱发插入突变， CRISPR/Cas9为解决这一问题提供了新的可能性，仅需一周即可完成CAR-T基因的编辑。




2.3 CAR-M的优势与挑战  

与CAR-T和CAR-NK细胞相似，CAR-M细胞由识别特定肿瘤抗原的细胞外信号传导域、跨膜区域和细胞内激活信号区域组成。目前，对细胞外信号域的研究主要几种在几种常见的肿瘤靶点，如CD19和HER2。

与CAR-T细胞不同，CAR-M细胞具有以下三个优点。

1）由于肿瘤细胞周围基质形成的物理屏障，T细胞不能进入肿瘤环境，而巨噬细胞可以明显地浸入肿瘤环境中。TAM在肿瘤侵袭、转移、免疫抑制和血管生成中起着重要作用。CAR-M能降低TAM的比例，影响TAM的细胞表型，对肿瘤的治疗有积极作用。

2）CAR-M除了具有吞噬肿瘤细胞的作用外，还具有促进抗原提呈能力和增强T细胞杀伤的作用。

3）与CAR-T相比，CAR-M的循环时间有限，非肿瘤靶向毒性较小。

尽管CAR-M有很大的潜力成为一种强有力的肿瘤免疫治疗方法，但要达到预期的效果还需要克服许多问题。

  • 首先是细胞数量的限制：无论是在体外还是在体内注射后，巨噬细胞都不会增殖。患者只能接受有限数量的巨噬细胞，这可能会影响治疗效果。


  • 二是与巨噬细胞在体内的迁移特性有关。注射后，外源性巨噬细胞通过肺部，然后大部分留在肝脏，不利于癌症的治疗。


  • 三是复杂的肿瘤微环境。尽管CAR-M在小鼠模型中取得了很好的效果，但人类实际的肿瘤微环境要比动物模型复杂得多。最后，由于肿瘤细胞的高度异质性，靶抗原的表达可能不够。这一问题在CAR-T治疗中一直非常突出。临床研究发现，大多数被CAR-T细胞去除的肿瘤细胞都有高水平的靶抗原表达。可以预见，这也将成为CAR-M疗法发展的一大障碍。




小结



NK细胞是一类独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受 MHC 限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能。CAR-NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。

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